Caracterización de Enzimas Digestivas, Digestibilidad in vitro y Síntesis de ADNc del Gen de Tripsina en Adultos de la Pigua Macrobrachium Carcinus
Keywords:
Palemonidos, macrobrachium, enzimas digestivas, hepatopáncreas, tripsinaAbstract
El presente estudio se dividió en tres partes: la primera comprende la caracterización de enzimas digestivas de adultos de la pigua Macrobrachium carcinus. La segunda parte consistió en la evaluación in vitro de la digestibilidad alcalina de extractos multienzimáticos de M. carcinus. En la tercera parte se determinó la secuencia del gen de tripsina a partir de la amplificación del ADNc de adultos de M. carcinus. Como resultados se obtuvo que la actividad proteolítica de M. carcinus se da a un pH óptimo de 8 y a una temperatura óptima de 45ºC, la actividad es inhibida por PMSF y por SBT1, lo que indica que la actividad proteolítica en los extractos de M. carcinus se da principalmente debido a la presencia de serín proteasas. Los ingredientes alimenticios utilizados, especialmente los de origen animal marino, mostraron alto (P>0.05) grado de hidrólisis. Se obtuvo una secuencia nucleotídica de 816 pb la cual codifica para una proteína de 272 aminoácidos con una masa molecular de 25 kDa. El alineamiento múltiple mostró un rango de de identidad de entre 18% y 24% con relación a las secuencias del gen de tripsina de otras especies de invertebrados. La combinación de estudios de caracterización enzimática con las pruebas de digestibilidad in vitro puede contribuir al diseño de dietas adecuadas para la reproducción y cultivo intensivo de M. carcinus, además de que el estudio de los genes involucrados en la digestión facilitan el entendimiento de la fisiología de la especie.Downloads
References
Albuquerque, C., F. García-Carreño, M. Navarrete del Toro. 2002. Trypsin and trypsin inhibitors from Penaeid shrimp. J. Food Biochem. 226, 233– 251.
Álvarez-González, C. A. 2003. Actividad Enzimática Digestiva y Evaluación de Dietas para el destete de Larvas de la Cabrilla Arenera Paralabrax maculatofasciatus (Percoidei: Serranidae). Tesis Doctoral, IPN-CICIMAR. 180 p.
Ásgeirsson, B., R. Hartemink & J. F. Chlebowski. 1995. Alkaline phospahtase from atlantic cod Gadus morhua. Kinetic and structural properties wich indicate adaptation to low temperatures. Comp. Biochem. Physiol. 110B, 315-329.
Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- Dye dinging, Anal. Biochem. 72, 248-254.
Brockerhoff, H., R. J. Hoyle & P. C. Hwang. 1970. Digestive enzymes of the American lobster Homarus americanus. J. Fish Res. Board Can. 27, 1357–1370.
Celis-Guerrero, L. E., F. L. García-Carreño, & M. A. Navarrete del Toro. 2004. Characterization of proteases in the digestive system of spiny lobster Panulirus interruptus. Mar. Biotechol. 6, 262–269.
Ceccaldi, H. J. 1997. Anatomy and physiology of the digestive system. En Crustacean Nutrition. Advances in World Aquaculture, 1997 Vol. 6 (Ed. By D’Abramo, L.R., Conklin, D.E. & Akiyama, D.M.). World Aquaculture Society, Baton Rouge, LA. USA. pp 261-291.
Chace, F. A. & H. H. Hobbs. 1969. The freshwater and terrestrial decapod crustaceans of the West Indies with special reference to Dominica. U.S. Natn. Mus. Bull. 292, 1-258.
Choudhury, P.C. 1971. Responses of larval Macrobrachium carcinus (L.) to variations in salinity and diet (Decapoda, Palaemonidae). Crustacean. 20, 113-120.
Cohen T., Gertler A. (1981). Pancreatic proteolytic enzymes from Cyprinus carpio I. Purification and physical properties of trypsin. Chymosin, elastase and carboxypeptidase B. Comparative Biochemistry and Physiology 69 B, 647-653.
Covich, A. P., T. A. Crowl, B. B. Yoshioka & M. S. Wright. 2003. Ecological factors determining the distribution of the omnivorous river shrimp Macrobrachium carcinus, in Puerto Rico. 08 Presented at the NABS Annual meeting, Athens, Georgia, in Tropical Stream Ecology II. http://www.benthos.org/database/allnabstracts.cfm/db/Athens2003abstracts/id/1
Debrot, A. O. 2003. The freshwater shrimps of Curacao, West Indies (Decapoda, Caridea). Crustaceana 76 1, 65-76.
Díaz-Tenorio, L. M., F. L. García-Carreño & M. A. Navarrete del Toro. 2006. Characterization and comparison of digestive proteinases of the Cortez swimming crab, Callinectes bellicosus, and the arched swimming crab, Callinectes arcuatus. Invertebrate Biology 125 2, 125–135.
Dunn, B. M. 1989. Determination of protease mechanism. pp. 57-81. En: R.J. Beynon y J.S. Bond (Eds.). Proteolytic Enzymes: A practical approach. I.R.L. Press, Oxford, England.
Escamilla-Treviño L. L. 2002. Producción de tripsina del camarón blanco del Pacífico (Penaeus vannamei) en Pichia pastoris. Tesis de Doctorado en Ciencias con especialidad en Biotecnología de la Facultad de Ciencias Biológicas, U.A.N.L., Monterrey, N.L., México.
Fernández Giménez, A. V., F. L. García–Carreño, M. A. Navarrete del Toro & J. L. Fenucci. 2002. Digestive proteinases of artemisa longinaris (decapada,penaeidae) and relationship with molting. Comparative Biochemistry and pHysiology Part B 132, 593-598.
Forhman, M.A., Dush, M.K. y Marti, G.R. (1988). Rapid production of full-length cDNAs from rare transcripts: Amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 8998-9002.
Galgani F. G., Benyamin Y., Van Wormhoudt A. (1985) Purification, properties and immunoassay of trypsin from the shrimp Penaeus Japonicus. Comparative Biochemestry and Physiology 81B, 447-452.
Gates B. J., Travis J. (1969) Isolation and comparative properties of shrimp trypsin (Penaeus setiferus) Biochemistry 8, 4483-4489.
Gibson. R. y Barker, P.L. 1979. The decapod hepatopáncreas. Oceanogr. Mar. Biol. Annual Reviews. 17, 285-346.
Guerrero-Olazarán M., Viader-Salvado J. M. (2003). Pichia pastoris como hospedero para la producción de proteínas recombinantes. In: Procesos Biotecnológicos. (Ed. By Galan-Wong L. J., Elias-Santos M., Tamez-Guerra P., Quintero-Ramírez R., Quintero-Zapata I.), pp. 136-156. Universidad Autónoma de Nuevo León. San Nicolás de los Garza.
Guerrero-Olazarán, M. Rodríguez-Blanco, L. Viader-Salvado, JM. 2007. Producción de una Fitasa recombinante en Pichia pastoris. CIENCIA UANL 10 (4), 413-418.
Galgani, F. & F. Nagayama. 1987. Digestive proteinases in the Japanese spiny lobster Panulirus japonicus. Comp. Biochem. Physiol. 87B, 889–893.
García-Carreño, F.L. 1992. Protease inhibition in theory and practice. Biotechnol. Education 3, 145-150.
García-Carreño, F. L., L. E. Dimes & N. F. Haard. 1993. Substrate-gel electrophoresis for composition and molecular weight of proteinases proteinaceous proteinase inhibitors. Anal. Biochem. 214, 65-69.
García-Carreño, F. L., M. A. Navarrete del Toro, J. M. Ezquerra. 1997. Digestive shrimp proteases for evaluation of protein digestibility in Vitro: I. The effect of protease inhibitors in protein ingredients. J. Mar. Biotech. In press.
García-Carreño, F. L., M. P. Hernández-Cortes, & N. Haard. 1994. Enzymes with peptidase and proteinase activity from the digestive system of fresh water and a marine decapod. J Agric Food Chem 42, 145–146.
Gillet, C. 1984. Population of the prawn and fish in the Guadalupe River (West Indies), some dates on their distribution on biology. Rev. Hydrobiol. Trop. 16, 327-340.
Glass, H. J. & J. R. STark. 1994. Protein digestion in the European lobster, Homarus gammarus (L.). Comp. Biochem Physiol 108b, 225-235.
Graziani, C. A., M. de Donato & K. S. Chung. 1995. Salinidades óptimas en larvas y postlarvas de Macrobrachium carcinus (L.) (Decapoda: Palaemonidae). Bol. Inst. Oceanogr. Venezuela 34, 33-40.
Graziani, C. A., K. S. Chung & M. de Donato. 1993. Comportamiento reproductivo y fertilidad de Macrobrachium carcinus (Decapoda: Palaemonidea) en Venezuela. Rev. Biol. Trop. 41, 657-665.
Hernández-Cortés, P., J. Whitaker & F. García-Carreño. 1997. Purification and characterization of chymotrypsin from Penaeus vannamei (Crustacea, Decapoda). J. Food Biochem. 21, 497–510.
Hernández-Cortés, P., Corenious, L. García-Carreño, L.F., Söderhäll, K. (1999) Trypsin from Pacifastacus leniusculus hepatopáncreas: Purification cDNA Cloning of syntetized zymogen. Biol. Chem. 380, 499-501.
Klein, B., Le Mullac, G., Sellos, D., and Van Wormhoudt, A. 1996. Molecular cloning and sequencing of trypsin cDNAs from Penaeus vannamei (Crustacea, Decapoda): Use in assessing gene expression during the moult cycle. Int J. Cell Biol. 28, 551-563.
Kunitz, M. 1947. Crystalline soybean trypsin inhibitor II. General propierties. J. Gen. Physol. 30, 291-310.
Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.
Lehninger, A., Nelson, D.L., Cox, M.M. 2008. Principles of Biochemistry. W.H. Freeman, E.U.A. 1119 pp.
Manríquez-Santos, T. 2009. Caracterización de enzimas digestivas y digestibilidad in vitro de adultos de la pigua Macrobrachium carcinus. Tesis de Licenciatura en Biología de la Universidad del Mar, Puerto Escondido, Oax., México
Maroux, S., Baratti, J., Desnuelle, P. 1971 J. Biol. Chem. 246, 5031-5039.
Muhlia-Almazan, A. y García-Carreño, F. L. 2003. Digestion physiology and proteolyti enzymes of crustacean species of the Mexican Pacific Ocean. Contributions to the study of East Pacific Crustaceans 2, 77-91.
Rudenskaya, G. N., Kislitsin, Y. A. y Rebrikov, D. 2004. Collagenolytic serine protease PC and trypsin PC from king crab Paralithodes camtschaticus: cDNA cloning and primary structure of the enzymes. BMC structural Biology, 4. http://www.biomedcentral.com/1472-6807/4/2
Rypniewski W. R., Perrakis, A., Vorgias, C. E. and Wilson, K. S. Evolutionary divergence and conservation of trypsin. Protein Engineering. 7, 57-64.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Gel electrophoresis of DNA en: Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.
Salvensen, G. & H. Nagase. 1989. Inhibition of proteolytic enzymes. pp. 83-104. En: R. Beynon and J.S. Bond (Eds.). Proteolytic enzymes. IRL Press Oxford. UK.
Stauffer C. 1989. Effect of pH on activity. In: Van Nostrand Reinhold, editor. Enzyme assay for food scientists. New York: AVI Press. p 61–76.
Stryer, L., J. M. Berg & J. L. Tymoezco. 2003. Bioquímica. 5ª ed. México. P. 209.
Sudaryono, A., E. Tsvetnenko & L. H. Evans. 1999. Evaluation of potential of lupin meal as an alternative to fish meal in juvenile Penaeus monodon diets. Aquacult Nutr 5,277–285.
Titani, K., Sasagawa, T., Woodbury, R. G., Ericcsson, L. H., Dorsam, H., Kraemer, M., Neurath, H. y Zwilling, R. 1983. Aminoacid sequence of crayfish (Astacus fluviatilis) trypsin I. Biochemistry. 22, 1459-1465.
Tsai, I., K. Chuang & J. Chiang. 1986. Chymotripsins in digestive tracts of crustacean decapods (Shrimps). Comp. Biochem. Physiol. 85B, 235-239.
Tsai I. H., Lu P., Chuang J. L., (1991) The midgut enzymes of shrimp Penaeus monodon, Penaeus japonicus and Penaeus penicillatus. Biochemica Biophysyca 1080, 59-67.
Walsh K. (1970) Trypsinogens and trypsins of various species. Methods in Enzymology 19, 41-63.
Vega-Villasante, F., I. Fernández, R. M. Preciado, M. Oliva, D. Tovar Ramírez & H. Nolasco. 1999. The activity of digestive enzymes during the molting stages of the arched swimming Callinectes arcuatus Ordway, 1863. Bulletin of Marine Science 65, 1-10.
Walter, H. E. 1984. Proteinases methods with haemoglobin, casein and azocell as substrates. En: Methods of enzymatic Analysis. H. J. Bergmeyer (eds) V: 270-277. Verlang Chemie. Weinheim, Alemania.
Wikins, J. F. 1976. Prawn biology and culture. En Barnes, H. (ED) Aberdeen University Press. Oceanografic. Mar. Biol. Ann. Rev. 1, 435-507.
Zwilling, R. H. & Neurath, H. 1981. Invertebrate proteases. Methods Enzymol. 80, 633-664
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3 www.cgi
